Ici nous appliquons les méthodes implémentées sur l'arbre de \cite{chenQuantitativeFrameworkCharacterizing2019}.

% TODO Décrire les données en détails

<< 'knitr_options', echo = FALSE>>=
knitr::opts_knit$set(cache = TRUE, fig.pos = "HT", fig.width = 6, fig.height = 6,
    fig.align = "center", echo = FALSE, format = "latex")

@

<< import_modules, echo = FALSE, include=FALSE>>=
necessary_packages <- c("phylotools", "phytools", "phylolm", "limma", "edgeR", 
    "here", "ggplot2", "patchwork", "dplyr", "tidyr", "UpSetR", "evemodel", 
    "compcodeR", "mvSLOUCH")

if (!all(necessary_packages %in% installed.packages())) {
    install.packages(necessary_packages)
    install.packages("remotes")
    remotes::install_gitlab("sandve-lab/evemodel")
    remotes::install_github("pbastide/compcodeR", ref = "phylolimma")
} else {
    require(phylotools)
    require(phytools)
    require(phylolm)
    require(limma)
    require(edgeR)
    require(here)
    require(ggplot2)
    require(dplyr)
    require(tidyr)
    require(UpSetR)
    require(evemodel)
    require(compcodeR)
    require(mvSLOUCH)
    require(patchwork)
}

source(here("R","utils.R"))
@

<< import_donnees, echo = FALSE>>=
### Data import
cdata <- readRDS(here("data", "data_TER", "data", "chen2019_rodents_cpd.rds"))
is.valid <- compcodeR:::check_phyloCompData(cdata)
if (!(is.valid == TRUE)) stop("Not a valid phyloCompData object.")

# Design
design_formula <- as.formula(~condition)
design_data <- compcodeR:::sample.annotations(cdata)[, "condition", drop = FALSE]
design_data$condition <- factor(design_data$condition)
design <- model.matrix(design_formula, design_data)

# Normalisation
nf <- edgeR::calcNormFactors(compcodeR:::count.matrix(cdata) / compcodeR:::length.matrix(cdata), method = "TMM")
lib.size <- colSums(compcodeR:::count.matrix(cdata) / compcodeR:::length.matrix(cdata)) * nf
data.norm <- sweep((compcodeR:::count.matrix(cdata) + 0.5) / compcodeR:::length.matrix(cdata), 2, lib.size + 1, "/")
data.norm <- data.norm * 1e6

# Transformation
data.trans <- log2(data.norm)
rownames(data.trans) <- rownames(compcodeR:::count.matrix(cdata))
@

\subsection*{Vanilla (ML et REML), Satterthwaite (ML et REML), LRT}
<< calcul_pvaleurs, echo = FALSE, warning = FALSE>>=
### Pvalues computation
pvalues_data = "chen2019pvalues.Rds"
pvalues_adj_data = "chen2019pvaluesadj.Rds"
if (!file.exists(here("data",pvalues_data)) | !file.exists(here("data",pvalues_adj_data))){
#  computing pvalues vec for all genes
    pvalue_vec_vanilla <- sapply(seq(1, nrow(data.trans)), function(row_id) {
        trait <- data.trans[row_id, ]
        fit_phylo <- phylolm(trait ~ design_data$condition, phy = cdata@tree, measurement_error = TRUE)
        compute_vanilla_pvalue(fit_phylo)
    })

    pvalue_vec_vanilla <- setNames(pvalue_vec_vanilla, rownames(data.trans))

    pvalue_vec_vanilla_adj <- p.adjust(pvalue_vec_vanilla, method = "BH")

    pvalue_vec_vanilla.REML <- sapply(seq(1, nrow(data.trans)), function(row_id) {
        trait <- data.trans[row_id, ]
        fit_phylo <- phylolm(trait ~ design_data$condition, phy = cdata@tree, REML = TRUE, measurement_error = TRUE)
        compute_vanilla_pvalue(fit_phylo)
    })

    pvalue_vec_vanilla.REML <- setNames(pvalue_vec_vanilla.REML, rownames(data.trans))

    pvalue_vec_vanilla_adj.REML <- p.adjust(pvalue_vec_vanilla.REML, method = "BH")

    pvalue_vec_satterthwaite <- sapply(seq(1, nrow(data.trans)), function(row_id) {
        trait <- data.trans[row_id, ]
        fit_phylo <- phylolm(trait ~ design_data$condition, phy = cdata@tree, measurement_error = TRUE)
        compute_satterthwaite_pvalue(fit_phylo, tree = cdata@tree)
    })

    pvalue_vec_satterthwaite <- setNames(pvalue_vec_satterthwaite, rownames(data.trans))

    pvalue_vec_satterthwaite_adj <- p.adjust(pvalue_vec_satterthwaite, method = "BH")


    pvalue_vec_lrt <- sapply(seq(1, nrow(data.trans)), function(row_id) {
        trait <- data.trans[row_id, ]
        fit_phylo <- phylolm(trait ~ design_data$condition, phy = cdata@tree, measurement_error = TRUE)
        compute_lrt_pvalue(fit_phylo, tree = cdata@tree)
    })

    pvalue_vec_lrt <- setNames(pvalue_vec_lrt, rownames(data.trans))
    pvalue_vec_lrt_adj <- p.adjust(pvalue_vec_lrt, method = "BH")

    # REML
    pvalue_vec_satterthwaite.REML <- sapply(seq(1, nrow(data.trans)), function(row_id) {
        trait <- data.trans[row_id, ]
        fit_phylo <- phylolm(trait ~ design_data$condition, phy = cdata@tree, REML = TRUE, measurement_error = TRUE)
        compute_satterthwaite_pvalue(fit_phylo, tree = cdata@tree, REML = TRUE)
    })

    pvalue_vec_satterthwaite.REML <- setNames(pvalue_vec_satterthwaite.REML, rownames(data.trans))

    pvalue_vec_satterthwaite_adj.REML <- p.adjust(pvalue_vec_satterthwaite.REML, method = "BH")


    ## Préparation du dataframe
        pvalues_adj_dataframe <- data.frame(
        gene = rep(rownames(data.trans), 5),
        pvalue = c(pvalue_vec_vanilla_adj,
            pvalue_vec_vanilla_adj.REML,
            pvalue_vec_satterthwaite_adj, 
            pvalue_vec_lrt_adj, 
            pvalue_vec_satterthwaite_adj.REML),
        test_method = rep(c( "VanillaAdj", "VanillaAdjREML",
        "SatterthwaiteAdj", "LRTAdj",
        "SatterthwaiteAdjREML"), each = nrow(data.trans))
    )

    pvalues_dataframe <- data.frame(
        gene = rep(rownames(data.trans), 5),
        pvalue = c(pvalue_vec_vanilla,
            pvalue_vec_vanilla.REML,
            pvalue_vec_satterthwaite, 
            pvalue_vec_lrt, 
            pvalue_vec_satterthwaite.REML),
        test_method = rep(c( "Vanilla", "VanillaREML",
        "Satterthwaite", "LRT",
        "SatterthwaiteREML"), each = nrow(data.trans))
    )

    pvalues_dataframe$test_method <- as.factor(pvalues_dataframe$test_method)
    pvalues_dataframe <- pvalues_dataframe %>% mutate(selected = ifelse(pvalue < 0.05, 1, 0))

    pvalues_adj_dataframe$test_method <- as.factor(pvalues_adj_dataframe$test_method)
    pvalues_adj_dataframe <- pvalues_adj_dataframe %>% mutate(selected = ifelse(pvalue < 0.05, 1, 0))

    save(pvalues_dataframe, file = here("data", pvalues_data))
    save(pvalues_adj_dataframe, file = here("data", pvalues_adj_data))
} else {
    load(here("data", pvalues_data))
    load(here("data", pvalues_adj_data))
}
@

Nous appliquons les différentes méthodes que nous avons implémentés dans le 
code.

Ci-dessous la figure~\ref{fig:pval-methods} présente les p-values des 
différentes méthodes. Il est important de noter que ce graphique présente les
p-values \emph{non ajustées}.

\begin{figure}[H]
    \centering
    << graphique_all_pvalues, echo = FALSE>>=
    all_plots <- plot_spacer()
    for (test in unique(pvalues_dataframe$test_method)) {
        all_plots <- all_plots + ggplot(pvalues_dataframe %>% filter(test_method == test)) +
            aes(x = reorder(gene, -pvalue), 
                y = pvalue, color = as.factor(selected)) +
            labs(color = "Selected", x = "Genes", y = "P-values")+
            # geom_bar(stat = "identity", position = "dodge") +
            geom_point()+
            geom_hline(yintercept = 0.05) +
            facet_grid(cols = vars(test_method)) +
            theme(axis.text.x=element_blank(), axis.ticks.x = element_blank())
    }
    all_plots + patchwork::plot_layout(guides = "collect", 
        axis_titles = "collect", tag_level = "new") + 
        plot_annotation(title = "Selected genes by tested methods")
    @
    \caption{\emph{p-values} pour les différents tests}
    \label{fig:pval-methods}
\end{figure}

Pour la suite de cette analyse, nous allons appliquer un ajustement des p-values
pour les test multiples, nommément la correction de Benjamini-Hochberg.


<< wide_data, echo = FALSE>>=
pvalues_adj_dataframe_wide <- pvalues_adj_dataframe %>% 
        pivot_wider(id_cols = gene, 
        names_from = test_method, 
        values_from = selected) %>%
        data.frame()
@

Une fois ces corrections appliquées, nous allons comparer les gènes sélectionnés,
c'est-à-dire différentiellement exprimés. % TODO Développer ce que veut dire différentiellement exprimé

Ces résultats sont présentés dans le diagramme de Venn (figure~\ref{fig:venn-all-methods})

\begin{figure}[H]
    << upset_selection, echo = FALSE>>=
    upset(pvalues_adj_dataframe_wide, 
        nsets = 5,
        mainbar.y.label = "Nombre de gènes en commun",
        sets.x.label = "Nombre de gènes sélectionnés")
    @
    \caption{Diagramme de Venn comparant les gènes sélectionnés selon les méthodes}
    \label{fig:venn-all-methods}
\end{figure}

\subsection*{EVEmodel}

<<'evemodel', echo = FALSE>>=
eve_data = "evechen2019pvalues.Rds"
if (!file.exists(here("data", eve_data))){

    # TODO comparer avec le package evemodel, twothetatest
    # Comparer avec OU lrt
    # Arbre sans les replicats et les genes data
    # remotes::install_gitlab("sandve-lab/evemodel")
    # TODO Utiliser les infos de la ligne 83 du Rmd

    cdataEVE <- readRDS(here("data", "data_TER", "data", "chen2019_rodents_cpd.rds"))
    is.valid <- compcodeR:::check_phyloCompData(cdataEVE)
    if (!(is.valid == TRUE)) stop('Not a valid phyloCompData object.')
    tree_rep <- compcodeR:::getTree(cdataEVE)
    tree_norep <- compcodeR:::getTreeEVE(cdataEVE)
    theta_2_vec <- compcodeR:::getIsTheta2edge(cdataEVE, tree_norep)
    #col_species <- tree_norep$tip.label[compcodeR:::sample.annotations(cdataEVE)$id.species]
    col_species <- tree_norep$tip.label[cumsum(!duplicated(compcodeR:::sample.annotations(cdataEVE)$id.species))]

    # Normalisation
    nfEVE <- edgeR::calcNormFactors(compcodeR:::count.matrix(cdataEVE) / compcodeR:::length.matrix(cdataEVE), method = 'TMM')
    lib.sizeEVE <- colSums(compcodeR:::count.matrix(cdataEVE) / compcodeR:::length.matrix(cdataEVE)) * nfEVE
    data.normEVE <- sweep((compcodeR:::count.matrix(cdataEVE) + 0.5) / compcodeR:::length.matrix(cdataEVE), 2, lib.sizeEVE + 1, '/')
    data.normEVE <- data.normEVE * 1e6

    # Transformation
    data.transEVE <- log2(data.normEVE)
    rownames(data.transEVE) <- rownames(compcodeR:::count.matrix(cdataEVE))

    # Analysis with EVE
    evemodel.results_list <- evemodel::twoThetaTest(tree = tree_norep, gene.data = data.transEVE, isTheta2edge = theta_2_vec, colSpecies = col_species, upperBound  =  c(theta = Inf, sigma2 = Inf, alpha = log(2)/0.001/1))

    result.table <- data.frame(pvalue = pchisq(evemodel.results_list$LRT, df = 1, lower.tail = FALSE), logFC = compcodeR:::getlogFCEVE(evemodel.results_list$twoThetaRes, theta_2_vec, tree_norep))
    result.table$score <- 1 - result.table$pvalue
    result.table$adjpvalue <- p.adjust(result.table$pvalue, 'BH')

    rownames(result.table) <- rownames(compcodeR:::count.matrix(cdataEVE))

    evemodel_dataframe <- data.frame(gene = rep(rownames(result.table)), 
        pvalue = c(result.table$adjpvalue),
        test_method = rep("EVEAdj", each = nrow(result.table)))
    save(evemodel_dataframe, file = here("data", eve_data))
} else {
    load(file = here("data", eve_data))
}

evegenesNA <- (evemodel_dataframe%>% filter(is.na(pvalue)))$gene

evemodel_dataframe <- evemodel_dataframe %>% 
    filter(!is.na(pvalue)) %>% 
    mutate(selected = ifelse(pvalue < 0.05, 1, 0))

evemodel_dataframe$test_method <- as.factor(evemodel_dataframe$test_method)
@

Dans l'article \cite{rohlfsPhylogeneticANOVAExpression2015}, les auteurs 
introduisent une méthode de détection des gènes différentiellement exprimés.
Cette méthode est à l'heure actuelle très utilisée.

\emph{Remarque :} La méthode a produit des \texttt{NA} pour certains gènes,
d'après le message d'erreur, une optimisation n'a pas convergé. Ces gènes sont
présentés dans le tableau~\ref{tab:na-evemodel}.

\subsection*{Toutes les méthodes}

Nous allons ici comparer toutes les méthodes dans un diagramme de Venn (figure~\ref{fig:venn-all-methods-eve}) afin de 
voir les gènes sélectionnés en commun et les éventuelles différences entre les 
méthodes.

<< pvalue_eve_upset, echo = FALSE>>=
pvalueseve_dataframe <- rbind(pvalues_adj_dataframe, evemodel_dataframe)

pvalueseve_dataframe_wide <- pvalueseve_dataframe  %>% 
    pivot_wider(id_cols = gene,
    names_from = test_method, 
    values_from = selected, values_fill = 0) %>%
    data.frame()
@

\begin{figure}[H]
    << full_plot, echo = FALSE>>=
    upset(pvalueseve_dataframe_wide, 
        nsets = 10,
        mainbar.y.label = "Nombre de gènes en commun",
        sets.x.label = "Nombre de gènes sélectionnés")
    @
    \caption{Diagramme de Venn de toutes les méthodes en incluant la méthode EVE}
    \label{fig:venn-all-methods-eve}
\end{figure}